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近一段时间正在努力学习单细胞相关的理论知识,发现单细胞测序和普通的真核细胞的转录组非常相似。两者之间的最大的区别在于,一个测的是单个细胞的表达,一个测的是一堆细胞的表达之和。所以从这里就可以理解,为什么网上很多教程都在说,单细胞数据是一个巨大的稀疏矩阵。假设,一个样本可以捕获一万个细胞,这时候单细胞的矩阵大小为:2w个基因*样本数*1万个细胞,而转录组数据的大小:2w个基因*样本数。两个矩阵相差了一万倍,巨大一词就是从此处而来。

我们要理解不是所有的细胞都要表达2w个基因,细胞在机体内有各自的分工,所以有的细胞可能就只表达了几百个基因,有的是几十个,有的是几千个,所以单细胞数据中会存在大量的零,这种数据又被称为稀疏矩阵。

那我们怎么做单细胞分析呢?

目前生信豆芽菜提供了两版单细胞分析工具

老版:http://www.sxdyc.com/singleCellTool

为了更加简单方便的使用单细胞分析,又推出了新版工具,新版本更加契合零基础的用户。首先,我们大致了解单细胞基本分析包括哪些?

数据读取,质控,过滤,去批次,亚群聚类,marker基因的筛选,特征基因的表达,新增注释信息

基本分析基本已经满足了常规的套路文章3分加点单细胞验证的水平,比如说之前我们上线零代码复现2,基于某一个特征基因集建模分型,最后筛选到关键的基因,这时候,我们可以使用单细胞的基础分析工具盒进行简单的验证。

首先进入生信豆芽菜官网(http://www.sxdyc.com/index)

目前只上线了一个基础分析的版本,后续会对其他分析陆续进行上线

接下来,我们看看怎么进行单细胞的基础分析

第一步:细胞读入+质控

这里有三种格式的数据选择,记得先下载示例数据看一下再开始进行分析

这三个压缩包都是,都是可以直接使用的数据。

这里我们以10x的数据为例,10x的标准数据一个样本一个文件夹,每一个文件夹包含了三个文件

然后全选这三个文件夹,压缩为zip,上传即可。

提交后,输入任务队列名

运行成功后,下载文件

第一个相关性越大越好,后面两个相关的越小越好

通过小提琴图展示形式,选择第二步细胞过滤的阈值。

第二步:细胞的过滤

这里根据第一步生成的vlnPlot.befor.pdf,输入筛选的阈值,这里的UMI就是图中的ncount,基因数量为nfeature,线粒体的百分比含量为percent.mt。

如这里UMI的默认写了100,50000则默认为100<UMI<50000。双向的选择也是为了剔除细胞碎片和双细胞,那么选多少合适呢?选多少都可以,没有固定的标准。

提交等待运行成功就可以了

第三步:去批次

在第二步中,通过TSNE/UMAP的图,查看样本细胞的分布,如果不同样本之间泾渭分明,差别很大,则选择去批次的方法,如果各个样本之间相互杂糅你中有我,我中有你,可以选择不去批次,这时候直接选择none即可。

这两个图即是去批次后的tsne/UMAP图。

第四步:亚群聚类

输入分辨率,输入的数值越大,分的亚群越多,默认输入0.1的分辨率

细胞的一个分组信息

第五步:特征基因表达的气泡图(该步骤可以运行也可以不运行)

该步骤设计的主要有两个

1、做亚群手动注释,需要我们提前查找文献筛选细胞marker基因。

2、查找某一个特定的功能集中的基因的表达情况

这里我随便找了几个基因进行绘图

这里的基因表达颜色是从低到高,不管选几个颜色都是可以的

第六步:新增注释信息

这里默认会对meta的信息进行整理,先导入数据

根据需求新增注释信息,每选择一次需要提交,可以提交多次,如果是亚群注释的信息,列名需要改为cell_type

第七步:marker基因的筛选

如果在第六步进行亚群注释,新增了一列cell_type,即可针对注释后的亚群进行marker基因的筛选,如果没有进行亚群注释,只能选择注释前,也就是聚类(seurat_clusters)进行marker基因的筛选

到这一步,基础分析就做完了,操作简单,调理清晰,是不是有眼前一亮的感觉,也许这就是真正在用心做的平台吧,会想要关心用户的使用。


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